&processing(스프라이싱, 프로세싱) RNA splicing

RNA는 유전자 발현의 중심 역할을 한다.지금까지 연구된 모든 RNA는 성숙하기 위해 추가적인 가공 절차가 필요함.

Interrupted gene(분단 유전자)는 모든 Eukaryote에서 발견되며 Intron을 제거하는 과정을 RNA splicing이라 한다.

Intron은 Pre-m RNA에서 제거된다.PremRNA는 핵의 1차 전자물로, modification되어 mRNA를 만들어 낸다.Pre-m RNA가 합성될 때 단백질이 결합된 형태인 RNP(ribonucleoprotein)를 형성하는데 이를 RNP라고 한다.

Interrupted gene(Intron과 Exon으로 분단된 유전자) 발현 과정. 1. 모든 사물의 5' 말단에서 capping(캡 형성) 2. Intron 제거 3.3' 말단에서 아데닌의 중합

위의 3단계를 거친 mRNA는 핵공(nuclear pore)을 통해 cytoplasm으로 이동되며 translation(번역)된다.

Pre-RNA가 합성될 때 단백질이 결합하여 ribonuceloprote in particle을 형성한다. hnRNP라고 부른다.

RNA는 원래 heterogeneous nuclear RNA라고 불렸다.이형핵RNA라는 뜻으로 RNA polymerase2에 의해 만들어진 RNA를 의미한다.

따라서 hnRNP는 hnRNA가 protein과 복합체를 이루고 ribonucleoprotein을 이루는 형태이다.일부 protein은 hnRNA를 포장(packaging)하는데 구조적인 역할을 한다.

 

RNA합성(=전사)은 Nucleoside tripohsphage(뉴클레오시드 3인산, 보통 푸린A, 또는 G)으로 시작된다.

첫 번째 뉴클레오티드는 5'triphosphate group (3인산 그룹)을 보유하고 있으며, 3' 위치에서 다음 뉴클레오티드의 5' 위치까지 phosphodister bond를 만든다.

따라서 모든 사물의 초기 sequence는 다음과 같다. 5'pp A/Gp Np Np

성숙한 mRNA를 개별 뉴클레오티드로 분해하는 효소 처리를 하면 5'의 말단 pp로 잘리지 않고 항상 구아닌이 검출된다.말단염기는 항상 전사 후 원래의 RNA 분자에 가해지는 구아닌이다.

5' 말단의 G첨가는 GT(구아닌 Transferase)에 의해 촉매된다.

GT 효소에는 2가지 활성이 있는데 하나는 GTP에서 2가지 인산염을 제거하는 triphosphatase(3인산 가수분해효소)로 작용하며, 하나는 RNA의 위안5'3인산말단에 구아닌을 결합시키는 구아닌 전달효소이다.

RNA의 말단에 가해진 새로운 G잔기는 모든 다른 Nucleotide와 반대방향으로 존재한다. ( 5 ' Gppp + 5 ' pppApNp ... → Gppp 5 ' - 5 ' Ap Np Np ..... + pp + p )

이러한 구조를 캡이라고 한다.캡 = mRNA의 말단에 5'GTP의 말단 인산염을 연결하여 전사시킨 후 EukaryotemRNA5' 말단에 존재하는 구조. 5'캡은 5'-5' 연결로 전 사물의 말단에 G를 부가함으로써 형성된다.

캡은 다양한 메틸화 과정에 대한 기질이다.

캡 형성 과정은 Polymerase2가 나머지 유전자를 전사하기 위한 생산적인 신장방식으로 들어가는데 중요하다.(= capping은 전사 과정에서 일어나며 전사 재출발에 중요한 역할을 한다.)

캡이 mRNA의 5' 말단을 봉쇄하고 여러 위치에서 메틸화할 수 있다.5'캡 형성을 위한 일시정지(pausing) 기작은 초기 일시정지 부위에서 전사 재개를 위한 확인점이다.= 부항은 전사 과정에서 일어나며 Reinitiation (재개 시)에 있어서 중요한 역할을 한다.

캡의 주요 기능은 mRNA가 분해되지 않도록 보호하는 것이다.핵에서 캡은 캡 결합 cBP20/80 heterodimer(이형이 합체)에 의해 인식되고 결합된다.이 결합과정은 최초의 Intron의 splicing을 촉진하고 mRNA 수송장치와의 상호작용을 통해 핵으로부터의 mRNA 수송을 용이하게 한다. cytoplasm에서는 (eIF4F 단백질)이 캡과 결합하여 mRNA의 번역을 시작한다.

캡 구조는 mRNA의 안전성, 스프라이싱, 수송(export) 및 번역에 영향을 주는 단백질 요소에 의해 인식된다.

 

핵스플라이싱 접합부는 짧은 염기서열이다.

스플라이싱 부위(splicing site)는 엑손-인트론의 경계를 바로 둘러싼 염기서열이다.이들은 인트론과 관련된 위치에 따라 명명된다.

Intron의 두 말단 사이에는 광범위한 상동성, 상보성이 없다.그러나 접합부는 다소 짧지만 공통 염기서열이 잘 보존되어 있다.엑손-인트론 접합부의 저장된 염기서열을 바탕으로 모든 인트론에 특정 말단을 지정할 수 있다.

보존성이 높은 염기서열은 접합부 인트론 내에서만 발견됨. GU......AG

인트론의 5' (왼쪽) 말단의 5's plicing site는 공통 염기서열 GU를 포함한다.인트론의 3' (오른쪽) 말단의 3's plicing site는 공통 염기서열 AG를 포함한다.

GU-AG 법칙을 따르는 대부분의 인트론 외에도 인트론의 일부는 엑손-인트론의 경계에 서로 다른 일련의 공통 염기서열을 갖는 예외가 있다.

핵 인트론의 말단은 GU-AG 규칙에 의해 규정된다. AU-AC 역할을 하는 부 인트론은 엑슨-인트론의 경계에서 서로 다른 일련의 염기서열인 AU-AC의 법칙을 따른다.

스프라이싱 접합부는 한 쌍으로 읽힌다.

 

스플라이싱 부위는 일반적(generic)이다.스플라이싱 장치는 조직 특이적이지 않다. 일반적으로 모든 세포에 의해 적절하게 스플라이싱될 수 있다.

스플라이싱은 스플라이싱 접합부에 존재하는 쌍의 인식에만 의존한다.모든 5's plice site는 기능적으로 동일하고 모든 3's plice site는 기능적으로 동일하다.

splicing 에는 5' , 3's plicing site 와 splicing site 의 바로 위(upstream) 부위의 Branch site 가 필요하다.Branch site는 Multicellular Eukaryote에서는 잘 저장되지 않는다.

pre-m RNA 스플라이싱은 함정(lariat) 형태로 이루어진다.

lariat: 꼬리가 있는 원형 구조로 5'에서 '2' 결합에 의해 생성되는 RNA splicing의 중간체

덫 형성: intron이 5' 위치에서 절단되고 5'의 말단이 인트론의 Branchsite A에서 2' 위치로 결합될 때 형성된다.

Intron이 3's plicing site에서 절단되면 덫 형태로 방출되며, 왼쪽과 오른쪽 Exon은 함께 연결된다.

splicing은 Transesterification으로 에너지를 필요로 하지 않는 반응이며, 한 위치에서 다른 위치로 결합이 전달되는 반응이다.

Spliceosome: -> RNASplicing에 필요한 sn RNP와 추가적인 Protein에 의해 생성된 복합체(spiceosome은 큰 입자로 Ribosome보다 질량이 크며, 5개의 sn RNP와 많은 추가적인 단백질을 포함.)

->spicing과 관련된 5개의 snRNP는 U1, U2, U5, U4, U6이다.각각의 snRNP에 공통된 구조적 핵심은 8개의 단백질 그룹으로 구성되며, 모두 Anti-Sm이라는 자가 면역 혈청으로 인식된다.

SnRNA→핵에 한정된 작은 RNA종으로 splicing이나, 다른 RNA의 가공(processing) 반응에 관여한다.

Ecomplex:splicing의 최초 복합체로 (U1sn RNP, ASF/SF2, U2AF, 연결 단백질 SF1/BBP)로 구성된다.

SR 단백질: Ser-Arg이 풍부한 영역을 가지고 있으며, 스프라이싱에 관여하는 단백질.

U1SnRNP는 RNA-RNA 결합반응에 의해 5's plicing site 부위에 결합함으로써 스프라이싱을 시작한다.

 

5' 부위와 3' 부위를 초기에 인식하는 방법은 두 가지 방법이 있는데 하나는 Intron definition이고 다른 하나는 Exon definition이다.

Intron definition -> 한 쌍의 Splicing site가 5' , branch site, 3'을 포함한 상호작용에 의해 인식되는 과정 (인트론에 걸쳐 일어나는 상호작용) -> U1sn RNP가 5'스프라이싱 부위에 결합하고 U2AF가 branch site와 3'splicing site 사이의 피리미딘 영역에 결합한다. Ecomx.

Exondefinition->인트론 자체에 염기서열 하향이 필요하다.보편적이지 않은 메커니즘. → 한 쌍의 스프라이싱 부위가 인트론의 5' 부위 및 다음 인트론의 드론의 다운스트ream 5' 부위를 포함한 상호작용으로 인식되는 과정.엑손에 걸쳐 일어나는 상호작용

Splicing이 완료된 후에만 cytoplasm으로 수송되는 메커니즘

EJC(exon junction complex): 엑슨-엑슨 접합부로 조립되어 9개 이상의 단백질로 구성된 RNA 수송 및 위치 지정, 분해를 돕는 단백질 복합체

REF 단백질은 EJC의 일부이다.REF 단백질은 splice osome과 결합하여 스프라이싱 접합부에 결합한다.REF 단백질은 핵공을 통해 RNA를 운반하는 수송 단백질 TAP/Mex와 상호작용한다.

자기 스플라이싱(Autos plicing, self-splicing) → 인트론 속의 RNA 서열에만 의존하는 촉매작용으로 자신을 RNA에서 절단하는 인트론의 능력

모든 유전자의 인트론은 크게 세 가지로 분류할 수 있다.

Pre-mRNA 인트론은 5' 말단과 3' 말단에서 GU...AG의 dinucleotide와 3' 말단에 branchsite 피리미딘 영역을 가지고 있다고 정의

세포소기관과 bacteria에서 발견되는 그룹 1, 그룹 2 인트론은 내부 조직에 따라 분류되며, 각각은 2차 구조를 취할 수 있다.그룹1, 그룹2 인트론은 RNA로부터 스스로 절단하는 자가 스프라이싱 능력을 가지고 있다.단백질에 의해 제공되는 효소활성을 필요로 하지 않고 자체적으로 시험관내(invitro)에서 스프라이싱 반응을 할 수 있다.

그룹 2 인트론의 스프라이싱 접합부와 스프라이싱 기작은 핵 인트론의 스프라이싱과 비슷하다.